Banyak cara dalam
pembuatan preparat jaringan tumbuhan, diantaranya adalah dengan metode parafin.
Metoda ini sekarang banyak digunakan, karena hampir semua macam jaringan dapat
dipotong dengan baik bila menggunakan metoda ini. Kebaikan-kebaikan metoda ini
adalah irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda
beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10
mikron, tapi dengan metode paraffin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6
mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila
menggunakan metode ini. Prosedurnya jauh lebih cepat dibandingkan dengan metode
seloidin. Namun metode paraffin juga memiliki kelemahan yaitu jaringan menjadi
keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat
dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim akan larut
dengan medode ini (Suntoro, 1983).
Metode paraffin
merupakan cara pembuatan sediaan dengan menggunakan parafin sebagai media
penanamna (embedding). Langkah-langkah dalam pembuatan sediaan tersebut adalah
(Tim MITEK Tumbuhan, 2002):
1. Pematian
dan fiksasi: Banyak larutan yang dapat digunakan untuk fiksasi, diantaranya
adalah larutan FAA (Formaldehyde Acetic-acid Alcohol), dengan komposisi sebagai
berikut: 50% atau 70% etilalkohol 90 cc, Asam asetat glacial 5 cc Formalin 40 %
5 cc. Setelah bahan dipotong kira-kira 0,5 cm segera dimasukkan ke dalam
larutan FAA dengan perbandingan 1: 20 (bahan 1/20 volume FAA), tidak boleh
lebih delapan potong didalam vial. Lama fiksasi dalam FAA bagi bahan yang kecil
atau tipis minimum 12 jam sedangkan untuk bahan yang besar atau tebal 24 jam.
2. Aspirasi:
Aspirasi dilakukan dengan menggunakaan vakum (aspirator) dan digunakan dengan
interval waktu yang pendek dan berkali-kali, dapat juga dengan menggunakan spet
suntik. .
3. Pencucian:
Pencucian dilakukan 2 kali dalam waktu 3 jam dengan akohol 50%. Jumlah larutan
dipakai hannya tepat menutupi bahan.
4. Dehidrasi
dengan TBA (Tertier Butil Alkohol), serta infitrsi: Dehidrasi dilakukan dengan
campuran etilalkohol dan TBA dalam konsentrasi tertentu yang masing-masing
dinamai larutan Johansen I sampai V.
5. Penanaman
(Embedding): Buat kotak keras yang agak tebal dengan ukuran kira-kira 5 X 2,5 X
2 cm- (panjang X lebar X tinggi), lalu isi dengan paraffin keras yang cair
dalam vial tadi, kemudian sebelum paraffin membeku masukkan bahan. Atur bahan
tersebut dalam kotak kertas dengan menggunakan jarum yang dipanaskan dengan
lampu alcohol atau spritus dan beri label. Setelah paraffin membeku dan bahan
tidak bergoyang, letakkan kotak kertas dalam air dingin. Biarkan permukaan
paraffin membeku, kemudian tekanlah seluruh kotak kedalam air sampai paraffin
membeku, atau dapat juga dimasukkan kedalam freezer sampai seluruh paraffin
sama sekali membeku. Baru setelah itu paraffin dapat dikeluarkan dari kotaknya.
6. Penyayatan:
Potong balok paraffin menjadi balok-balok kecil yang masing-masing mengandung
sebuah bahan. Balok-balok paraffin itu ditempelkan pada balok kayu menurut arah
sayatan yang dikehendaki. Penempelan dilakukan dengan mencairkan sebagian balok
paraffin dengan jarum yang telah dipanasi, kemudian meletakkan balok paraffin
pada kayu. Lakukan hal itu beberapa kali sehingga balok paraffin menempel
dengan kuat pada balok kayu. Permukaan dari balok paraffin yang telah
ditempelkan sebaiknya empat persegi atu bujur sangkar. Perhatikan bahwa sisi
horizontal harus benar-benar sejajar. Bahan yang ada dalam balok paraffin
disayat dengan mikrotom putar (rotary microtome). Sebelum dipotong balok yang
telah ditempeli bahan dan pisau didinginkan dahulu dengan air dingin (kulkas),
sehingga suhu paraffin sama dengan suhu pisau. Balok kayu yang telah ditempel
dengan balok paraffin dipasang pada pemegang yang terdapat pada mikrotom.
Aturlah tebal sayatan (biasanya antara 6-15 mikron) dengan memutar skrup pada
sisi kanan mikrotom. Pasang pisau pada mikrotom. Pada waktu pemutar mikrotom
dijalankan, bahan dalam paraffin yang telah diletakkan pada pemegang bergerak
naik turun dan maju kedepan. Peganglah sayatan-sayatan paraffin yang berbentuk
pita itu dengan kuas halus. Pita paraffin hasil sayatan disimpan pada kotak
karton atau baki preparat. Sebaiknya pemotongan dilakukan di ruangan ber-AC.
7. Penempelan
sayatan: Cara penempelan adalah sebagai berikut:
·
Teteskan larutan perekat pada kaca obyek
sebesar tetesan kecil, gosok perekat tersebut sampai rata pada kaca obyek
dengan ujung jari hingga membentuk lapisan tipis.
·
Teteskan larutan formalin diatas kaca
obyek yang telah diberi perekat tadi. Letakkan sayatan diatasnya, dan letakkan
kaca obyek tersebut diatas papan pemanas selama 30 menit. Usahakan agar sayatan
paraffin merata pada permukaan kaca obyek. Amati dibawah mikroskop diseksi.
Periksa apakah sayatan bahan telah rata benar.
·
Isaplah kelebihan larutan formalin yang
terdapat pada sisi sayatan dengan kertas pengisap.
8.
Pewarnaan: Untuk mewarnai bahan yang
telah ditempel tersebut adalah dengan cara merendamkan kaca obyek tersebut
kedalam bejana pewaarna (bejana coplin), biasanya dibutuhkan bejana coplin
tersebut kira-kira 12 buah, tergantung dengan pewarna yang kita pakai.
Masing-masing bejana diberi label dengan nama zat yang berada didalamnya,
demikian pula dengan tutupnya.
